Pemeriksaan HIV Immunocomb

Tujuan Penggunaan

Immunocomb II HIV I & II Bispot Kit adalah tes rapat yang digunakan untuk deteksi kualitatif dan membedakan antibodi human immunodeficiency virus tipe I dan II (HIV I & HIV II) di serum atau plasma manusia. Tiga puluh enam tes dapat dilakukan dengan satu kit.

Pengenalan

Human immunodeficiency virus (HIV) adalah retrovirus, diidentifikasi pada 1983 sebagai agen etiologis dari accure immunodeficiency syndrome (AIDS). Bisa dibedakan menjadi dua subtipe yaitu HIV I & HIV II. Rute utama dari transmisi HIV adalah kontak seksual, kontaminasi dari darah atau produk barang, dan transmisi dari ibu ke yang baru lahir. Sel utama yang diinfeksi oleh HIV adalah CD4 limfosit yang berperan sebagai kunci dalam sistem pertahanan dari organisme. Penurunan agresif dari level CD4 pada saat perkembangan dari permulaan penyakit ke infeksi oportunis dengan konsekuensi fatal. Virus HIV terdiri dari molekul RNA dilindungi oleh kapsid dan envelope. Envelope HIV adalah target utama dari respon antibodi humoral. Diagnosis serologi dari infeksi HIV berdasarkan pada deteksi spesifik terhadap antibodi hingga protein envelope HIV.

Prinsip Tes

Tes immunocomb II HIV 1 dan 2 Bispot adalah suatu fase ezim immunoassay solid tidak langsung (EIA). Fase solid adalah sebuah kartu dengan 12 proyeksi (gigi). Setiap gigi disensitisasi pada 3 titik :

Titik atas-antibodi kambing terhadap immunoglobulin manusia (control internal)

Titik tengah-HIV 2 peptida buatan

Titik bawah-HIV 1 peptida buatan

Plat pengembangan punya 6 baris (A-F) dan 12 lubang, setiap baris mengandung larutan reagen siap digunakan pada tahap berbeda di uji tersebut. Tes ini menampilkan langkah yang diatur dengan memindahkan kartu dari baris ke baris dengan inkubasi pada masing-masing langkah.

Untuk memulai tes, specimen serum/plasma ditambahkan pengencer pada di baris A dari plat pengembangan kartu kemudian dimasukkan ke sumur/lubang dibaris A. antibody anti-HIV jika ada pada specimen akan terikat spesifik dengan peptide buatan pada titik bawah dan/atau titik tengah pada gigi dari kartu. Sekaligus, keberadaan immunoglobulin pada specimen akan ditangkap oleh antibody anti-human immunoglobulin pada titik atas (control internal). Komponen yang tidak terikat dicuci dibaris B, baris C dan baris O, specimen IgG yang ditangkap pada gigi akan bereaksi dengan antibody manusia diberi label dengan alkalin phosfat. Pada baris berikutnya, komponen tidak terikat debuang dengan pencucian. Pada baris F, alkalin fosfat yang terbatas akan bereaksi dengan komponen kromogen. Hasilnya dilihat sebagai titik biru ke abu-abuan pada permukaan gigi dari kartu.

Gambar 1. Prinsip Tes

Kit mengandung kontrol positif (mengandung antibody terhadap HIV-1 dan HIV-2) dan control negative termasuk pada setiap pengujian dilakukan. Pada penyelesaian tes, gigi yang digunakan dengan control positif harus menunjukkan 3 titik biru keabu-abuan dan yang menggunakan control negative harus menunjukkan hanya pada titik atas. Titik atas juga harus menunjukkan pada semua gigi lain untuk memastikan bahwa specimen yang ditambahkan, bahwa fungsi kit seyogysnya (tepat) dan tes dilakukan secara benar.

Isi Kit

Cards (kartu)

Kit berisi 3 kartu plastik. Setiap kartu memiliki 12 ‘teeth’ (gigi). Satu tooth (serangakai gigi) untuk setiap tes (gambar 2). Setiap tooth disensitasi dengan tiga area reaktif.

Titik atas – antibody kambing terhadap immunoglobulin manusia (kontrol internal)

Titik tengah – peptide HIV-2 sintetik (derivate dari env glikoprotein gp36)

Titik bawah – peptide HIV-1 sintetik (derivate dari env glikoprotein gp41 dan gp 120)

Kartu disediakan dalam kemasan alumunium yang berisi kantong pengawet.

Developing Plate

Kit berisi 3 Developing Plate (plat pengembangan) yang dilapisi alumunium foil. Setiap Developing Plate (gambar 3) berisi semua reagen yang dibutuhkan untuk tes. Developing Plate berisi 6 baris (A-F) dengan 12 well (lubang/sumur) setiap barisnya. Isi setiap Baris adalah sebagai berikut.

Baris A : pengencer spesimen

Baris B : larutan pencuci

Baris C : ALP – yang dilekati goat anti-human antibodies

Baris D : ALP – yang dilekati goat anti-human antibodies

Baris E : larutan pencuci

Baris F : larutan substrat kromogen berisi 5-bromo-4chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) dan nitro blue-terazdium (NBT)

Kontrol positif – 1 vial (tutup berwarna merah) berisi 1mL plasma manusia positif antibodi anti-HIV-1 dan anti-HIV-2 yang diencerkan dan di-inaktivasi dengan penambahan -propiolactone dan dipanaskan.

Kontrol negatif – 1 vial (tutup berwarna hijau) berisi 1mL plasma manudia yang di-inkativasi dengan pemanasan, negative antibodi HIV.

Perforator – untuk melubangi alumunium foil yang membungkus well dari Developing Plate.

Keamanan dan Pencegahan

§   Perlakukan kontrol positif sebagai bahan yang tetap berpotensi sebagai bahan infeksius walaupun sudah tidak aktif.

§   Semua bahan yang digunakan yang berasal dari manusia dalam persiapan kontrol harus dicek dan ditemukan tidak reaktif dari hepatitis B antigen permukaan, dan untuk antibodi terhadap virus hepatitis C dan HIV. Sejak hasil pemeriksaan memberikan hasil sempurna, tidak menjamin kontaminasi viral, semua pengencer referensi dan semua smpel yang berasal dari manusai harus ditangani sebagai bahan infeksius.

§   Gunakan sarung tangan dan jas lab, ikuti prosedur yang berlaku untuk bekerja dengan serum atau plasma.

§   Jangan gunakan pipet dengan mulut.

§   Atur semua sampel, menggunakan kartu, plat, atau bahan lain yang digunakan dalam kit seperti pembuangan biohazard.

§   Jangan campur reagen yang berbeda lots.

§   Jangan gunakan alat setelah tanggal kadaluarsa.

§   Masing-masing gigi dalam combs dan masing-masing lubang dalam plate hanya bisa digunakan sekali.

Penyimpanan dan Stabilitas kit.

§   Kit dikirim pada suhu 2-8^o c. Selama pengiriman kit disimpan pada suhu < 30^o c untuk waktu yang pendek tidak lebih dari 48 jam.internal kontrol indikator dalam kit tidak rusak selama transport atau pengiriman.

§   Simpan kit pada kotaknya pada suhu 2-8^o c.

§   Kit jangan dibekukan.

§   Pantau kapan kit pertama kali di buka, komponen kit harus disimpan di suhu 2-8^o c.

§   Daya kit setelah dibuka pertama kali stabil sampai masa kadaluarsa, ketika disimpan pada suhu 2-8^o c.

§   Setelah digunakan, kartu dan plate tidak dapat digunakan untuk tiga kali pemakaian.

§   Hubungi distributor lokal jika terdapat beberapa kerusakan.

Penanganan Sampel.

1.        Kamu harus menguji tiap serum atau plasma.

2.        Sampel dapat disimpan lebih dari 7 hari pada suhu 2-8^o c sebelum di uji. Untuk penyimpanan lebih dari 7 hari, bekukan pada suhu -20^o c atau lebih.

3.        Semua sampel yang beku harus disentrifuse pada 10.000 rpm selama 5 menit pada suhu ruangan (22-26^o c). Hati-hati memindahkan sampel tes dari supernatan. Jika terbentuk lapisan lemak diperukaan cairan, pastikan bahwa sampel di ambil dari cairan yang jernih. Hindari pengulangan pembekuan dan pencairan.

4.        Antikoagulan seperti heparin, EDTA, dan natrium sitrat tidak berefek terhadap hasil pemeriksaan.

Prosedur Pemeriksaan

Peralatan yang dibutuhkan :

-            Pipet berpresisi dengan tip dispossible ukuran 50 µL

-            Gunting

-            Penunjuk waktu

Persiapan Pemeriksaan

Siapkan semua komponen, developing plates, kartu, reagen dan spesimen ke suhu ruang (22-26^oC) dan periksa pada suhu ruangan (22-26^oC).

Persiapan developing plates

1.        Inkubasi developing plates di incubator pada suhu 37O C selama 20 menit, atau biarkan di suhu kamar (22-26^oC) selama 3 jam

2.        Lap meja dengan kain yang menyerap bahan bahan berbahaya pada akhir pemeriksaan

3.        Campurkan reagen dengan mengocok developing plate

Catatan : jangan membuka tutup foil dari developing plate. Robek tutup foil dengan menggunakan tip dispossible dari pipet atau dengan pelubang, hanya ketika diinstruksikan untuk melakukannya oleh intruksi pemeriksaan.

Persiapan kartu

Peringatan : untuk memastikan tes berfungsi baik (layak) , jangan mengenai gigi kartu

1.        Basahi kantong alumuunium kartu pada bagian pinggir. Keluarkan kartu

2.        Dapat digunakan seluruh atau sebagian kartu dan developing plate. Untuk menggunakan bagian dari kartu :

a.         Tentukan berapa banyak gigi yang diperlukan untuk memeriksa spesiemen dan kontrol. Hanya membutuhkan satu gigi untuk masing masing pemeriksaan.masing masing gigi menunjukan kode “32” pada kit, untuk memungkinkan identifikasi gigi yang terlepas.

b.         Bengkokan dan patahkan kartu secara vertical atau potong dengan gunting (lihat no.4) untuk melepas nomor gigi yang diperlukan (no pemeriksaan mencakup 2 kontrol)

c.         Kembalikan vbagian yang tidak terpakai ke kantong alumunium (dengankantong penyerap debu) . tutup kantong dengan kuat, misalnya dengan jepitan kertas, untuk mempertahankan kekeringan. Simpan kartu dalam kotak kit yang asli pada 2-8O C selama penggunaan.

Petunjuk Pemeriksaan

Reaksi antigen antibodi (baris A developing plate)

1.        Pipet 50µL spesimen, lubangi penutup kertas foil pada satu well dibaris A developing plate dengan tip pipet atau perforator dan keluarkan spesimen pada bawah sumur. Campur secara berulang pengisian ulang dan mengeluarkan larutan.buang tip pipet.

2.        Ulangi langkah 1 untuk spesimen yang lain, termasuk kontrol positif dan negatif yang tersedia pada kit. Gunakan well yang baru dibaris A dang anti tip pipet untuk masing masing spesimen atau kontrol.

3.        A. masukan kartu (tertera dibagian luar) ke dalam sumur baris A ayng berisi spesimen dan kontrol. Campur : ambil dan masukkan kartu disumur beberapa kali.

B. biarkan kartu dibaris A selama tepat 10 menit. atur petunjuk waktu. Campur tambahan dua kali selama inkubasi. Hamper 10 menit berakhir, lubangi kertas foil pada garis B menggunakan perforator. Jangan membuka well yang lain selain yang diperlukan.

C. setelah 10 menit, ambil kartu keluar dari baris A. serap larutan dari gigi tip yang tajam pada kertas bersih yang bisa menyerap. Jangan menyentuh permukaan depan gigi.

Pembilasan pertama (baris B)

4.        Masukkan kartu kedalam well baris B. aduk : menarik dan masukkan kartu kedalam well paling cepat selama 10 detik untuk mencapai pembilasan yang tepat. Ulangi pengadukan beberapa kali selama 2 menit, sementara itu lubangi kertas foil baris C. setelah 2 menit, ambil kartu dan serap larutan seperti pada langkah 3C.

Pengikatan konjugasi (baris C)

5.        Masukkan kartu kiedalam well baris C.campur kartu beberapa kali. Atur waktu selama 10 menit. campurkan seperti pada langkah 3B. lubangi kertas  foil baris D. setelah 10 menit, ambil kartu dan serap larutan.

Inkubasi konjugasi (baris D)

6.        Masukkan kartu kedalam well baris D. aduk berulang selama 2 menit, seperti pada langkah 4. Sementara itu lubangi kertas foil baris E. setelah 2 menit ambil kartu dan serap larutan.

Pembilasan ketiga (baris E)

7.        Masukkan kartu kedalam well baris E. aduk berulang selama 2 menit, sementara itu lubangi kertas foil baris F. setelah 2 menit, ambil dan serap larutan

Reaksi warna (baris F)

8.        Masukkan kartu kedalam well baris F. campur seperti pada 3A. atur waktu selama 10 menit. campur seperti pada langkah 3B.setelah 10 menit ambil kartu.

Reaksi berhenti (baris E)

9.        Masukkan kartu kembali ke garis E. setelah 1 menit ambil kartu dan biarkan kartu kering diudara.

Penyimpanan Bagian yang Tidak Digunakan dari Kit

Developing plat

Jika tidak menggunakan semua sumur/well dari Developing plat, boleh disimpan untuk penggunaan berikutnya :

·           Segel sumur yang digunakan dengan pita perekat sehingga tidak ada yang bisa tumpah dari lubang, bahkan jika Developing Plat terbalik.

Bahan kit lainnya

·           Kembalikan sisa Developing Plat (s), kartu (s), perforator, kontrol dan instruksi ke dalam kotak kit asli. Simpan pada suhu 2-8°C.

Hasil Uji

Validasi

Untuk mengkonfirmasi bahwa pengujian berfungsi dengan baik dan utuk menunjukan bahwa hasilnya valid, tiga kondisi berikut harus dipenuhi (lihat gambar 5)

1.        Kontrol positif harus menghasilkan 3 titik pada gigi kartu.

2.        Kontrol negatif harus menghasilkan titik diatas (internal kontrol) dan tidak ada titik lain.

3.        Setiap spesimen yang diuji harus menghasilkan titik diatas (internal kontrol). Hal ini yang bisa menegaskan bahwa spesimen sudah ditambahkan. Jika salah satu dari kondisi tersebut tidak terpenuhi hasilnya tidak valid dan spesimen dan kontrol harus diuji ulang.                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                  

               Kontrol positif         Kontrol negatif                  Hasil Tidak Valid           

Gambar 5. Tes Validasi

Interpretasi Hasil

Satu-satunya titik diatas yang muncul (internal kontrol) mengindikasikan bahwa spesimen non rekatif untuk antibodi HIV 1/HIV 2 (gambar 6a) melingkar, ditengah berwarna menunjukan adanya antibodi terhadap HIV-2 (gambar 6b) melingkar, berwarna lebih rendah menujukan adanya antibodi terhadap HIV-1 (gambar 6c). Kadang-kadang, konsentrasi tinggi dari antibodi anti-HIV 1 atau anti HIV-2 telah ditemukan untuk menghasilkan titik sekunder, dengan titik mayor yang lebih kuat dengan antigen homolog (lihat gambar 6d untuk konsentrasi HIV tinggi). Dalam kasus infeksi HIV-1/HIV-2, dua titik dengan intensitas yang sama akan muncul.

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               

a.tidak ada                  b. Anti-HIV 2             c. Anti-HIV 1             d.Konsentrasi tinggi anti

antibodi anti-HIV                                                                                  HIV 1

Gambar 6. Hasil Tes

Penting :

·           Adanya antibodi terhadap HIV-1 atau HIV-2 pada spesimen yang diuji harus dikonfirmasi oleh uji konfirmasi.

·           Setiap warna samar pada gigi harus dicurigai untuk mewakili rekasi positif dan harus diselidiki lebih lanjut.

Dokumentasi Hasil

Warna pada kartu sudah stabil, kartu dapat disimpan untuk dokumentasi selanjutnya.

Pembatasan

Immune comb II HIV 1 dan 2 BiSpot kit merupakan screening tes. Reaktifitas antibody HIV 1 / HIV 2 tidak boleh dianggap untuk mendiagnosis AIDS / infeksi  HIV karena produksi antibody HIV mungkin tertunda setelah paparan awal. Non reaktifitas dengan tes ini tidak boleh dianggap sebagai bukti bahwa pasien belum terkena atau terinfeksi oleh HIV. Pemeriksaan ini ditujukan untuk masyarakat umum dan tidak digunakan pada specimen bayi baru lahir. Pengguna yang dimaksud dari tes ini adalah teknisi laboratorium dan tenaga kesehatan.

Karakteristik Kinerja

A.      Studi multicenter

Studi ini dilakukan di Eropa pada pasien yang terinfeksi 550-HIV-1 dan 260-HIV-2 maupun HIV negative pada darah donor. Hasil terperinci di tabel 1

Tabel 1 studi multicenter

HIV status	Immunocomb II HIV 1 & 2 BiSpot
	Positif		Negatif
	HIV-1	HIV-2
Positif HIV-1	550	0	0
Positif HIV-2	0	260	0
Negatif	12		1988

Berdasarkan karakteristik kinerja telah dihitung:

Sensitivitas – 100%

Spesifitas – 99,4%

B.       Spesimen pasien yang berasal dari Afrika

Studi yang dilakukan pada spesimen dari orang afrika termasuk 127 pasien yang terinfeksi HIV-1, 62 pasien terinfeksi HIV-2, 15 pasien terinfeksi keduanya HIV-1 dan HIV-2, dan 304 pasien dengan HIV negatif. Hasil terdapat pada tabel:

Tabel 2 sensitivitas & spesifisitas dengan spesimen orang Afrika

HIV-status		Immunocomb II HIV-1 & HIV-2 BiSpot
		Positif		Negatif
		HIV-1	HIV-2
Positif	HIV-1	127	0	0
	HIV-2	0	62	0
	HIV-1 & HIV-2	15	15	0
Negatif		5		299

Berdasarkan karakteristik kinerja telah dihitung:

Sensitivitas – 100%

Spesifitas – 98,4%

C.       Seroconversi

Kemampuan kit immunocomb II HIV-1 & HIV-2 BiSpot untuk mendeteksi seroconversi HIV-1 dengan dini yang telah dinilai  pada 10 panel serokonversi (boston Biomedica, USA) dengan western blotting seperti referensi pada pemeriksaan. Deteksi serokonversi dengan kit immunocomb II HIV 1 & 2 BiSpot sebelumnya dideteksi oleh western blotting dengan rata-rata dari 8,5 hari.

D.      Sampel serokonversi awal

Kit Immunocomb II HIV-1 & 2 BiSpot telah dievaluasi pada 40 sampel serokonversi awal. Immunocomb II HIV 1&2 BiSpot dimaksudkan untuk mendeteksi antibodi untuk HIV 1& 2, dan tidak dirancang untuk mendeteksi antigen yang diproduksi pada tahap awal infeksi sebelum antibodi muncul. Meskipun faktanya, 4 sampel serokonversi awal dari 40 sampel dalam tes yang diuji tidak dikenali oleh Immunocomb II HIV 1 & 2 BiSpot.

E.       HIV-1 Sub-Tipe O

Kemampuan

Tempat evaluasi	Tahun	Sumber	Nomor sampel	Sensitivitas* (%)
Israel	1994	Panel setempat (Cameroon)	12	100
Perancis	1994	Panel setempat	9	100
Perancis	1995	Panel setempat	12	100
Perancis	1999	Panel setempat	12	100
Perancis	2002	Panel setempat	12	100

F.        Sampel segar

Kit immunocomb II HIV 1 & 2 BiSpot telah diuji dalam sampel segar di hari yang sama(≤ 1 hari setelah pengambilan sampel). Penilaian ini menunjukkan sensitivitas 100% untuk pemeriksaan Immunocomb II HIV 1 & 2 BiSpot

Tipe Sampel	Hasil yang diharapkan	Hasil ImmunoCom® II HIV 1 & 2 BiSpot	Hasil Metode
Sampel Serum Segar Positif HIV 1	Positif	11/11	11/11
Sampel Plasma Segar Positif HIV 1	Positif	12/12	12/12
Sampel Serum Segar Positif HIV 2	Positif	2/2	2/2
Sampel Plasma Segar Positif HIV 2	Positif	2/2	2/2
Sampel Serum Segar Negatif HIV 1	Negatif	2/2	2/2
Sampel Plasma Segar Negatif HIV 1	Negatif	1/1	1/1
Total 30/30

Sensitivitas-100%

Spesifitas-100%

Pengulangan

Satu Serum positif diuji 12 kali pada 10 kartu dan hasilnya dibaca secara visual. Dalam semua kasus, serum positif terdeteksi.

Reproduktifitas

Tiga serum positif diuji pada masing-masing 10 kit terpisah dan Hasilnya dibaca secara visual. Dalam semua kasus, serum positif terdeteksi.

Reaktivitas-Silang

Reaktivitas silang dengan sampel positif penyakit lain seperti virus Hepatitis A, HAvIgM, HBsAg, HBsAb, virus Hepatitis C, HTLV, Rubella, Cytomegalovirus dan Toxoplasma ditemukan tidak signifikan.

Interferensi

Tidak ada interferensi spesifik dengan pengujian yang telah diamati. Spesimen menunjukan hiperlipidemia (kolesterol hingga 281,6 mg/dL, Trigliserid hingga 381,0 mg/dL) atau Hemolisis (hemoglobin hingga 10 mg/dL) dapat digunakan.

Arti Simbol

CARD	Kartu ImmunoComb®
PLATE	Plat yang dikembangkan
CONTROL + CONTROL -	Kontrol Positif Kontrol Negatif
PERFORATOR	Alat Pembuat Lubang
i	Instruksi Penggunaan
!	Peringatan, Dokumen yang menyertai
IVD	Alat Diagnostik secara in vitro
	Limitasi Suhu
Σ n	Cukup untuk Pengujian
	Pabrikan
REF	Nomor Katalog
LOT	Kode Jumlah
	Waktu Pemakaian
SN	Nomor Serial

Ringkasan Prosedur Uji Utama

Pra Inkubasi dari Plat yang dikembangkan selama 3 jam, pada suhu kamar (22-260C) atau 20 menit pada 370C.

Agitasi Plat yang dikembangkan sebelum setiap pengujian berjalan. Tarik sampel dan Kontrol

Tambahkan Sampel dan kontrol ke baris A, Campurkan

Pindahkan kartu dari Kantung

Sisipkan Kartu dan Campu di baris A. Campur secara berkala selama inkubasi.

Lubangi Baris B

Serap cairan yang melekat dari gigi

Sisipkan Kartu dan Agitasi di baris B. Inkubasi

Setelah tercampur dan inkubasi di baris C, D dan E

Reaksi Warna di baris F

Baca Hasil

Ringkasan Prosedur Pengujian

Intruksi Singkat dibawah ini untuk pengguna berpengalaman dalam Kit ImmunoCom® II HIV 1 & 2 BiSpot. (Untuk Intruksi lebih rinci silahkan mengacu pada teks lengkap).

1.        Bawa semua komponen, plat yang dikembangkan, kartu, reagen dan sampel pada suhu kamar dan lakukan pengujian pada suhu kamar (22-26⁰C).

2.        Ambil 50µL dari setiap sampel dan control ke sumur terpisah baris A dari Plat yang dikembangkan dan Campurkan.

3.        Sisipkan kartu di baris A dan Lanjutkan seperti yang dijelaskan di table 1.

4.        Selama inkubasi di sumur A, C dan F, Tarik dan Sisipkn kartu secara berkala,

Tabel 1. Ringkasan Prosedur Uji

Langkah	Baris	Prosedur yang diikuti
Reaksi Antigen-Antibodi	A	Campur; Inkubasi 10 Menit; Serap
Pencucian	B	Agitasi; Inkubasi 2 Menit; Serap
Pengikatan Konjugat	C	Campur; Inkubasi 10 Menit; Serap
Pengikatan konjugat	D	Agitasi; Inkubasi 2 Menit; Serap
Pencucian	E	Agitasi; Inkubasi 2 Menit; Serap
Reaksi Warna	F	Campur; Inkubasi 10 Menit
Reaksi Akhir	E	Inkubasi 10 Menit; Keringkan di udara

       

Bengkokkan dan Patahkan Kartu